如果把一滴油，滴到水里，会看到怎样的景象？
油会平铺在水面上，自动形成一个个或大或小的圆形油滴。
这个现象，你可能已经见怪不怪了。
但你听说过牛顿被苹果砸发现万有引力的励志故事吧，那么你观察到油在水面自动形成圆形油滴，能发现什么呢？水面的油为何不是形成三角形、正方形、正六边形呢？
学过物理的你，应该能回答：油不溶于水且轻于水，浮在水面的油，因为表面张力而收缩。在油滴体积不变的情况下，收缩成圆形/球形，是表面积最小的，所以我们看到了自动呈现圆形/球形的油滴。
言归疫苗。
有一类疫苗，业界称其为病毒样颗粒（VLP，Virus-Like Particle）疫苗，顾名思义就是看上去长得就像病毒的疫苗，只是其内部没有主宰病毒生命的核酸，所以不会感染人。
VLP疫苗，与前面说的水面的油自动形成圆球形有关系么？
有。
实际上，构成VLP疫苗的材料是能刺激人体产生免疫力的特定病毒蛋白（抗原蛋白），不同病毒的抗原蛋白不同，但诡异的是： 在液体中，这些抗原蛋白几乎都能自动聚集成正二十面体的球形！长得很像病毒！
典型的病毒颗粒就是 正二十面体 ，眼熟么？
很像病毒的VLP疫苗，有什么技术优势？
疫苗要取得良好的保护效果，尽量模拟病原微生物是一个很好的技术路线。人体如果能像识别病原微生物那样识别疫苗，那么这款疫苗成功的可能性就很大。
具体来说，VLP疫苗具有和天然病毒颗粒类似的空间立体结构和成分，能够通过类似病毒感染的途径刺激人体免疫系统，高效诱导人体产生免疫保护反应。
而且，VLP疫苗还具有佐剂效应，类似于打游戏自带外挂，效果更上一层楼。
VLP疫苗看上去很优秀，以前怎么没听说过？
其实不然，VLP疫苗就在我们身边，乙肝疫苗、戊肝疫苗、宫颈癌疫苗都是现役经典的VLP疫苗，另外还有基于VLP技术很多疫苗在研发中。
疫苗针对的病原体，主要可以分为细菌类疫苗和病毒类疫苗。VLP疫苗既然是病毒样颗粒疫苗，那么就和细菌类疫苗无关，而是病毒类疫苗的一种技术路线。
VLP技术平时很少被说起，因为它实际上是蛋白疫苗的一种立体结构，蛋白疫苗（多数是基因工程重组蛋白）才是我们耳熟能详的一种主流技术路线。
如果把一个个蛋白比喻为一粒粒沙子，那么沙子可以是一盘散沙，也可以是一个个沙堡。
蛋白疫苗之于VLP疫苗=沙子之于沙堡
沙堡是沙子做的，但沙堡和沙子，并不是一回事。
一堆沙子不可能自动形成一个沙堡，然而若干个蛋白聚在一起，无需科学家去干预，竟然可以自动形成正二十面体的病毒样颗粒，这就是VLP疫苗的神奇之处。
究其根本原因，还要从像解释水面的圆形油滴那样，从物理学/数学上寻求答案，可能的机制我猜是：
同等质量或体积，球体的表面积最小。正多面体最多只有正二十面体，而正二十面体是最接近于球形的几何结构，在表面张力的作用下，多个病毒蛋白如果要自动搭建出某种立体结构，那么正二十面体就是最佳选择。
神奇的正二十面体
VLP疫苗在疫苗界的江湖地位如何？
可以说，VLP疫苗是疫苗技术分类的一个小分支，曾经没有存在感，但最近有点热门。
主流的病毒类疫苗技术路线分类主要是：活疫苗、灭活疫苗和蛋白疫苗。另外，从埃博拉疫苗和COVID-19疫苗开始，病毒载体疫苗和mRNA疫苗也登上了历史舞台。
活疫苗，含有真正的活病毒颗粒。灭活疫苗，则含有灭活的真病毒颗粒。蛋白疫苗，只含有一种或几种能刺激人体产生免疫力的病毒抗原蛋白，不含有真病毒颗粒。
腺病毒载体疫苗和mRNA疫苗，本质上是记录蛋白结构的图纸，而不是蛋白疫苗本身。所谓图纸，是指这两种疫苗含有编码病毒抗原蛋白的特定基因，后者会进到人体细胞内表达出病毒抗原蛋白（就像按图纸造楼房一样），进而刺激人体免疫系统。
把现役的病毒类疫苗，按技术路线整理成下面这张表，就一目了然了。
在蛋白疫苗里，如果不看COVID-19疫苗，一共有5种疫苗，VLP疫苗覆盖了其中的4种，如此高比例，难道只是巧合么？
让我们逐个VLP疫苗一探究竟吧。
一、乙肝疫苗
在讨论VLP疫苗的历史时，乙肝疫苗是当之无愧的全球首个VLP疫苗，然而当时并没有VLP这个概念，首个VLP疫苗的江湖地位，完全是后封的。
最初的乙肝疫苗于1982年上市，被称为血源乙肝疫苗，是从乙肝携带者的血液中提取灭活制成，其主要成分是乙肝表面抗原蛋白（HBsAg）组装成的球形颗粒，直径约22纳米。
这种来自血液的乙肝疫苗颗粒，和电镜中的乙肝病毒亚层结构非常相似，这是其预防效果良好的重要原因之一。由于伦理、产量和安全性等原因，1986年起基于基因工程的重组蛋白乙肝疫苗问世，很快就取代了血源乙肝疫苗。
乙肝疫苗，看起来就像乙肝病毒内的二十面体核心
基因工程乙肝疫苗，是把表达HBsAg的基因转入酵母菌或哺乳动物细胞，利用后者批量生产出HBsAg蛋白制成的，神奇的是： 这种HBsAg蛋白被生产出来后，会自动组装成正二十面体的VLP颗粒。
权威的疫苗学著作——普罗特金著《Vaccine》第6版，在介绍基因工程乙肝疫苗时，这样表述： 表达的HBsAg多肽自动装配成免疫原性球形颗粒，酷似慢性乙肝感染者血清中所发现的天然22纳米颗粒，这些疫苗颗粒与自然颗粒的区别只在于HBsAg的糖基化。这个表述中，并没有出现VLP病毒样颗粒的说法。
乙肝疫苗的生产企业，可能觉得乙肝疫苗历史悠久，保护效果已经足够让人满意，各家都是VLP疫苗，所以没有必要把VLP概念引入自家疫苗的说明书里以强调其技术优势。
博尔纳公司乙肝疫苗说明书，未见VLP或病毒样颗粒
笔者看过中国市场上所有的乙肝疫苗说明书，其【成分与性状】的描述大意均为： 本品由XX菌/细胞表达的HBsAg经纯化，加入铝佐剂后制成…… 无一出现出现“VLP”或“病毒样颗粒”的说法。
二、宫颈癌疫苗
全球第一个HPV疫苗（宫颈癌疫苗）——默沙东的4价疫苗，于2006年在美国上市。之后，史克的2价疫苗，默沙东的9价疫苗和厦门万泰的2价疫苗陆续上市。
从宫颈癌疫苗开始，VLP的概念被写入了疫苗说明书。 《Vaccine》第6版在介绍宫颈癌疫苗时，也明示： 目前商业化的预防HPV病毒的疫苗都是基于VLP的疫苗。
不过在面向公众和预防接种管理人员的宫颈癌预防宣传中，宫颈癌疫苗通常只是被宣传为基因工程的重组蛋白疫苗，极少被提及还是一种VLP疫苗。
宫颈癌4价疫苗中文版说明书里明示VLP
宫颈癌疫苗的VLP，成分和结构都值得研究。
首先，天然HPV病毒颗粒的外壳主要由两种结构蛋白构成——L1蛋白和L2蛋白。研究发现，单独的L1蛋白或是L1与L2蛋白一起，都能自动装配成VLP，其结构与天然HPV病毒颗粒几乎没有差别，具有良好的免疫效果。
单独的L2蛋白，倒是无法自动装配成VLP，但其与L1蛋白一起装配VLP，可以提高装配效率和提高结构的稳定性，可以理解为沙子和石块形成的混凝土更加牢靠。
不过，L1蛋白自动装配成的VLP已经足够好，所以现役的4种宫颈癌疫苗全都只用L1蛋白。
如果你以为一堆L1蛋白会像变形金刚那样，奇奇咔咔就自动装配成VLP，那你错了。首先要有5个L1蛋白聚合成一个五聚体，然后72个五聚体才自动装配成一个VLP，一个VLP包含360个L1蛋白。
还有一点很重要，用基因工程表达的L1蛋白直接装配出来的VLP，大大小小、形态各异，稳定性较差。所以，还需要对其进行纯化，先解聚得到单体L1蛋白，再重新组装成VLP。重装VLP整齐划一，更加紧凑、颗粒更大、表面凸起更显著，质量更稳定，免疫原性更佳。
下表是全球4种宫颈癌疫苗的上市情况、技术路线和L1蛋白含量。
上表中，每种宫颈癌疫苗的L1蛋白含量，均用重量单位μg（微克）来表示。然而，如果了解到宫颈癌疫苗是一种VLP疫苗，则应该意识到：仅用重量单位来评价L1蛋白，损失了其立体结构信息。
100微克一盘散沙的L1蛋白，和100微克形成VLP的L1蛋白，怎么可能是一回事呢！
如果A疫苗中100微克L1蛋白只有50%形成了VLP，B疫苗中100微克L1蛋白有90%以上都是VLP，虽然两者都是100微克，但B疫苗的免疫效果很可能优于A疫苗，这是显而易见的，只要承认VLP比散沙蛋白的免疫原性更强。
这在乙肝疫苗上，已经有所体现。
乙肝疫苗目前有三种重组技术载体：啤酒酵母、汉逊酵母和CHO细胞。有研究发现，同样10微克的乙肝疫苗，不同技术表现出来的免疫原性会略有差异。
同为酵母，汉逊酵母表达的HBsAg，其形成完整VLP的比例高于啤酒酵母。在一些人群研究（不是全部）中发现，接种同等剂量不同技术的乙肝疫苗，汉逊酵母乙肝疫苗的抗体水平或阳转率会更高些（并未发现保护率的差异）。
这就带来了VLP疫苗质量评价标准的问题。
VLP疫苗质量的优劣，除了比较重量，还要比较VLP的含量。这就需要验证VLP的完整性，同时对VLP进行计量，两者结合起来才是更好的质量指标。
也许，将来宫颈癌疫苗的L1蛋白指标会变成： XX微克（90%VLP）。其中的XX微克仍然是L1蛋白的重量，90%VLP则是结构完整VLP的百分比。
VLP疫苗是单体蛋白装配出来了，那么用不同的单体蛋白能否装配出一个混搭的VLP球呢？答案是肯定的。
混搭VLP示意图
目前，宫颈癌疫苗做到了9价，含有L1蛋白共270微克。相比4价疫苗，其针对最致癌的16型和18型HPV的L1蛋白，分别增加了50%和100%，这很可能是因为抗原蛋白多了会互相竞争/干扰，所以不得不加大剂量。如果基于现有VLP技术去做覆盖更多HPV型别的疫苗，在成本控制和安全性上的挑战很大。
2018年12月，厦门大学生命科学院研究团队在Nature Communication上发表了宫颈癌疫苗嵌合VLP的论文，这项技术有望突破传统VLP技术恐难覆盖更多HPV型别的瓶颈。
厦大团队先确定了20个高致病型别HPV病毒（导致了99%以上的宫颈癌和90%以上的尖锐湿疣），再根据其L1蛋白进化顺序上的远近关系，把20个型别HPV病毒分为7组（6个为三个型别一组，1个为两个型别一组），同一组里的多个型别L1蛋白利用环交换技术做成嵌合VLP。
基于上图种第1组三个型别HPV病毒，他们构建了HPV33-52-58嵌合型五聚体，再由72个嵌合五聚体构成正二十面体的VLP。在冷冻电镜下，第1组嵌合型VLP与单独HPV33型VLP进行比较，肉眼很难看出差异。
这个第1组嵌合型VLP，在小鼠和非人类灵长类动物中产生的中和抗体，与单独用这三个型别VLP产生的中和抗体滴度相当，能有效预防这三个型别病毒的感染。
用同样的方法，厦大团队又把进化树上第2、3、5和6组的嵌合VLP都构建出来了。经过小鼠验证，这4组嵌合VLP的中和抗体水平与各型别VLP混合的中和抗体水平相当。
厦大团队认为：经过改进，他们可以设计一种包含7组嵌合VLP、针对20个型别HPV病毒的宫颈癌疫苗，预防超过99%的宫颈癌和90%以上的尖锐湿疣。
三、戊肝疫苗
全球首个且目前唯一的戊肝疫苗（厦门万泰的益可宁），2011年在中国获批上市。2015年，世界卫生组织为戊肝疫苗颁布了立场文件。
益可宁利用大肠杆菌表达戊肝病毒表面的结构蛋白P329，也是一种基因工程重组蛋白疫苗。其VLP的形成分为三步：第一步，两个P329蛋白聚合为二聚体；第二步，5个二聚体聚合为十聚体；第三步，72个十聚体自动装配成正二十面体VLP。
戊肝疫苗益可宁的电镜照片
《Vaccine》第6版出版时，尚无戊肝疫苗上市，其介绍了三种正在研究中的戊肝疫苗，一种是 益可宁，另一种是史克公司和Novavax公司基于基因工程棒状病毒/昆虫细胞表达的产品，三者都是VLP疫苗。
不过， 益可宁说明书里并未像宫颈癌疫苗说明书那样明示VLP。只是表述为：基因工程大肠埃希菌表达的戊肝病毒结构蛋白经纯化，复性并加铝佐剂混合制成。
戊肝疫苗说明书 ，未见VLP或病毒样颗粒
笔者认为，戊肝疫苗晚于宫颈癌4价疫苗5年问世，生产企业应该知道VLP的概念，但可能不认为这是一种值得明示的技术（毕竟是自动装配的），所以没有在说明书里提及。
戊肝疫苗VLP和宫颈癌疫苗VLP的形成过程相比，除了步骤多了一步，其抗原蛋白也有所不同。
宫颈癌疫苗的VLP由HPV病毒的全长L1结构蛋白装配，戊肝疫苗的VLP由戊肝病毒结构蛋白（ORF2）基因截短表达的P329蛋白装配，可以让VLP更加稳定。有人也研究了截短宫颈癌疫苗的L1蛋白，发现适当截短确实可以让VLP更稳定，但截多了可影响VLP的装配。
四、流感疫苗
流感疫苗是目前技术路线最眼花缭乱的疫苗（没有之一），包括：有活疫苗、灭活疫苗、裂解疫苗、高剂量疫苗、新型佐剂疫苗、蛋白亚单位疫苗、重组蛋白疫苗等。
1997年，瑞士的Crucell/Berna公司上市了一种使用类病毒体（Virosomal）技术的蛋白亚单位流感疫苗Inflexal V。这个Virosomal和VLP，在对疫苗立体结构的描述上，没有实质性区别。
作为一种亚单位疫苗，Inflexal V的纯度高，且生产工艺不含甲醛和硫柳汞，可引起过敏的卵清蛋白含量在当时的流感疫苗里最低。 在健康和免疫功能低下的老年人、成人和儿童中均显示出良好的免疫原性。
Inflexal V有 两点不同于前面三种VLP疫苗：
其一，Inflexal V的原料，不是基因工程表达的重组蛋白，是鸡胚培养的流感病毒进行充分裂解、纯化后的亚单位蛋白——HA蛋白以及卵磷脂，两者都是非基因工程表达的；
其二，双层卵磷脂形成膜结构的VLP骨架，HA蛋白插入卵磷脂膜形成VLP，这种VLP不是正二十面体，但看上去更像流感病毒。
流感病毒（左），Inflexal V的VLP（右）
Inflexal V的中文名为【因福舒】，2006年曾进入中国市场，2010年起无销售。其包装的英文名称中有“Virosomal”字样，翻译成中文变成了毫无关系的“亚单位”，没能体现类病毒体这个技术特点，无法与普通的亚单位疫苗区分开。
VLP的字面意思是病毒样颗粒，但人们在讨论VLP疫苗时往往默认VLP疫苗都是基因工程重组蛋白疫苗。 Inflexal V提醒我们，从字面定义来看，类病毒体疫苗妥妥地也是VLP疫苗。不过，随着疫苗技术的发展，将来的VLP疫苗应该是 基因工程重组蛋白疫苗的天下。
Crucell/Berna公司还将其流感病毒类病毒体（IRIV）技术用于其甲肝灭活疫苗Exapal，还比 Inflexal V早一年（2005年）在中国上市，中文商品名：爱巴苏。爱巴苏应该是中国首个类病毒体/VLP疫苗。
Exapal的中文包装盒上没有提到 “Virosomal”或“ 类病毒体”，只是在说明书的【作用与用途】里这样描述道（大意）： IRIV是 Berna公司开发的一项免疫增强技术，用流感病毒血凝素吸附在卵磷脂脂质体双层面上构建IRIV，这些携带了灭活甲肝病毒的 IRIV可以与免疫细胞上的受体主动结合，激发免疫应答。
甲肝病毒颗粒的直径为27纳米，前述 三种经典VLP疫苗的颗粒直径在20～30纳米，如 果IRIV与这些VLP的颗粒直径在同一尺度上，似乎很难说成功携带灭活的甲肝病毒。
实际上， IRIV颗粒直径为150纳米，而流感病毒的直径是80～120纳米，所以 IRIV看上去就是一个大号的流感病毒。 IRIV的直径是甲肝病毒颗粒直径的5.6倍，相当于足球与乒乓球，那么足球表面粘多个乒乓球还是可以想象的， Exapal的电镜照片和模拟图确实如此。
关于VLP的表达系统：
绝大多数VLP疫苗是基因工程重组蛋白疫苗，用于表达VLP结构蛋白的表达系统分为真核表达系统和原核表达系统，前者包括哺乳动物细胞、酵母细胞、杆状病毒/昆虫细胞、植物细胞，后者主要有大肠杆菌。目前已报导的VLP疫苗约70％基于真核表达系统，30％基于原核表达系统。
各种表达系统都有各自的优缺点， 哺乳动物细胞表达病毒蛋白最逼真、但产量低，稳定性不足；酵母细胞应用广泛，产量大，可以表达嵌合VLP，逼真度不如哺乳动物细胞，蛋白糖基化不足； 杆状病毒/昆虫细胞在逼真度、产量方面都有优势，但需要注意杆状病毒和VLP颗粒接近，分离纯化难度大；大肠杆菌的优缺点与酵母细胞类似。
VLP的包膜与层数：
病毒分为有包膜病毒和无包膜病毒两大类，前者结构复杂，构建VLP的难度大，但可设计性也更强。一般认为，无包膜VLP可以由原核表达系统和低级真核表达系统实现，有包膜VLP只能在真核表达系统，还需要宿主膜嵌入技术支持，挑战很大。
戊肝病毒和HPV病毒为无包膜病毒，其VLP疫苗为无包膜VLP。乙肝病毒和流感病毒是有包膜病毒，但乙肝疫苗为无包膜VLP疫苗，流感VLP疫苗则是另类VLP。这可能意味着，对于有包膜病毒并非必须构建有包膜VLP，但如果能实现有包膜VLP，可能效果会更好。
另外，VLP可以实现双层，甚至三层，可以插入不同的病毒蛋白，实现多价疫苗或者多联疫苗的效果。
正在开发中的人用VLP疫苗包括：
手足口疫苗（EV71病毒）、手足口2价疫苗（EV71病毒+CA16病毒）、呼吸道合胞病毒疫苗、诺如病毒疫苗、埃博拉疫苗、流感疫苗、基孔肯雅病毒疫苗、艾滋病疫苗、疟疾疫苗、COVID-19疫苗等。
上述COVID-19疫苗，是指Novavax的创新佐剂重组S蛋白纳米颗粒疫苗（商品名：Nuvaxovid），已经完成了Ⅲ期临床试验，其效果和安全性与两款获批的mRNA疫苗相当。其VLP结构不是病毒蛋白自动装配的正二十面体，而是由附着在纳米颗粒上的重组蛋白聚集而成，不能否认这也是一种VLP。
Nuvaxovid成品示意图
中国则在2021年批准紧急使用了全球第一款COVID-19重组蛋白疫苗（商品名：智克威得），其基于RBD蛋白，使用传统氢氧化铝佐剂。 智克威得的RBD蛋白为二聚体结构，没有自动装配成VLP，不算VLP疫苗。 但是，其免疫效果超过了腺病毒载体疫苗和灭活疫苗。
正在开发中的动物VLP疫苗包括：
口蹄疫疫苗、小反刍兽疫疫苗、猪繁殖与呼吸综合征疫苗、猪圆环病毒疫苗（Ⅱ型）、猪细小病毒疫苗、高致病性禽流感疫苗、新城疫疫苗、裂谷热疫苗、蓝舌病毒疫苗等。
总结：
各种VLP疫苗的基本原理相似，即对病原体进行研究，找到免疫原性好且能自动装配成VLP的抗原蛋白，通过合适的表达系统和工艺，制备成VLP疫苗。
正在开发的人用VLP疫苗，有很多有现役疫苗，是因为基于基因工程重组蛋白构建VLP，可以完全人工设计、能对VLP进行多种修饰满足不同需求，其免疫原性和安全性的可控程度高，正在成为疫苗研发的热点方向。
（完）
参考文献：
https://doi.org/10.1016/S0163-7827(99)00017-X
DOI: 10.1186/s12951-021-00806-7
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DOI :10.13309/j .cnki .pmi .2001.03.013
